支原體檢測試劑盒qPCR (經(jīng)典法)

Venor®Gem qEP

支原體qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

支原體檢測試劑盒qPCR (經(jīng)典法)優(yōu)點：

①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：

①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設計不同），需謹慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導下使用。

支原體檢測試劑盒qPCR (經(jīng)典法)介紹

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒（均為探針法檢測），依據(jù)操作步驟的細微差別，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

此兩類試劑盒較全球其他廠家同類產(chǎn)品，具有以下*的優(yōu)點：

①經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性，一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測到107種支原體物種。操作簡單，易于觀察。

（使用MB的試劑盒，下表中列出的支原體物種均為陽性，其他微生物或真核細胞均為陰性，無交叉反應）

③高靈敏度，MB公司的經(jīng)典法試劑盒檢測限可達到≤10CFU/ml。

MB公司的一步法qPCR試劑盒檢測限≥50個基因組/反應。

④MB公司有相應配套的10CFU/100CFU的敏感度測試的標準品，便于方法學驗證。

⑤MB公司有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA，便于特異性驗證。

⑥MB公司有相應配套的支原體絕對定量標準品，便于最后定量檢測。

qPCR Kit (經(jīng)典法)特點：

1. 內(nèi)控對照為獨立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2. 高特異性，一次檢測即可涵蓋所有常見易感染細胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細菌和真核DNA無交叉反應。

3. 高靈敏度，檢測限可達到≤10CFU/ml。

4. 有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA，便于特異性驗證。

5.有相應配套的支原體絕對定量標準品，便于最后定量檢測。

操作步驟：

第1步：樣本處理

a.細胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明：

①樣品基質(zhì)可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實現(xiàn)最高靈敏度。

推薦：德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒

Venor® Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗證。

第2步：試劑制備

a. 凍干粉溶解

b. 反應體系制備

b1) 樣品為細胞上清篩查——反應體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應體系制備

第3步：啟動熒光定量PCR儀

第4步：結(jié)果判別

FAM通道：檢測支原體熒光信號。HEX通道：檢測內(nèi)控對照熒光信號。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。

定量需基于Ct值和DNA標準曲線。

Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

示意圖：

儲存條件

2~8℃保存至少12個月。復溶后-18℃以下保存。

效期

1年6個月