培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、器皿或其他容器，生存空間及營養(yǎng)有限，當細胞增殖到一定密度后，分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，使細胞更好地生存，這一過程稱之為“傳代"(passage或subculture)。

值得注意的是：每次傳代細胞在生長和增殖方面受到一定的影響。

（一）細胞生命期(life span of culture cells)

指細胞在培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時間。一般根據(jù)細胞種類、性狀和原供體的年齡的情況而定。

例如：二倍體成纖維細胞，在不凍存和反復傳代條件下可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維持一年左右的生命，細胞便開始凋亡(apoptosis)。

細胞在生存過程中經(jīng)歷以下三個階段

1.原代培養(yǎng)期(primary culture)

組織到第一次傳代 時間大約為1～4周

特點：細胞活躍移動,分裂,但不旺盛多呈二倍體核型。

原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結構和功能活動基本相似。

各細胞的遺傳性狀互不相關，細胞相互依存性強，如果把這種稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)細胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細胞獨立生存性差。

2.傳代期(passage)

初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代便稱之為細胞系(cell line)

特點：細胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代或傳代早期凍存為好。

一般細胞在10代以內(nèi)凍存。

凍存配方：

向培養(yǎng)液加入保護劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

存于在液氮中溫度可達到－196℃，可長期儲存。如解凍后細胞復蘇，仍能繼續(xù)增殖生長，細胞性狀不受影響，成為保存細胞最主要的手段。

3.衰退期

特點：細胞仍生存—增殖減慢—不增殖—輪廓增強—衰退凋亡

注意：細胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化(spontaneous transformation);

細胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性 (malignancy)。細胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細胞群體稱為連續(xù)細胞系(continuous cell line)。當細胞獲得不死性后,細胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

（二）培養(yǎng)細胞一代生存期

“ 一代"指細胞接種到分離再培養(yǎng)的所用的時間。與細胞倍增一代不是一個含義。在細胞一代中，細胞能倍增3～6次，經(jīng)歷三個階段：

貼附現(xiàn)象是復雜和受多種因素的影響。

細胞不貼附：底物表面不干凈，影響細胞貼附。

利于細胞貼附：底物表面帶有陽性物質(zhì)與特殊物質(zhì): 纖粘連蛋白(fibronectin FN)、細胞表面蛋白(cell surface protein CSP)

這些物質(zhì)有的存在與細胞表面,有的來自血清。

1.潛伏期(latent phase) ：

接種 經(jīng)過懸浮期(細胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形)貼壁。

初代培養(yǎng)細胞經(jīng)過 10～24小時或更多時間。

連續(xù)細胞系和癌細胞系經(jīng)過10～30分鐘貼附。

潛伏期特點：

長短與細胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關。

(1)細胞貼附后進入潛伏期,細胞無增殖。少見分裂相，細胞有運動活動。

(2)初代培養(yǎng) 細胞潛伏期約為24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期約6～24小時。

(3)細胞接種密度大潛伏期短。

(4)細胞出現(xiàn)分裂相增多時，標志細胞進入指數(shù)增生期。

2.指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)：

特點：細胞增殖最旺盛階段,分裂相增多，細胞分裂指數(shù)(mitotie index MI) ：表示每1000個細胞中的分裂相數(shù)。

條件：分裂相數(shù)與細胞種類、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關。

細胞分裂指數(shù)：

初代細胞：在0.1％～0.5％之間％ ,

連續(xù)分裂細胞和腫瘤細胞：3 ～5％。

指數(shù)增生期是作為細胞一代活力很好的時期,是進行實驗最好和最主要的階段。

指數(shù)增生期持續(xù)3～5天，細胞數(shù)量增多后生長空間變小，細胞相互接觸可連接成片。

正常細胞：細胞相互接觸能抑制細胞運動，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contact inhibition)。

腫瘤細胞：沒有這種現(xiàn)象，可作為區(qū)別正常與腫瘤細胞的標志之一。當腫瘤細胞達到一定密度后向三維空間發(fā)展，使細胞發(fā)生堆積(piled up)。

由于細胞不斷增殖分裂，細胞數(shù)量持續(xù)增多，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Density inhibition),導致細胞分裂停止。

3.停滯期(stagnate phase)

細胞量和密度達到飽和，細胞停滯增殖。表明細胞進入到停滯期,細胞數(shù)量持平，也稱為平頂期(plateau）。

特點：細胞不增殖,有代謝活動。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低，此時需要傳代,否則細胞將會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細胞會從底物脫落死亡。

注意：傳代過晚將影響下一代細胞的生長,至少要再傳 1～2代 。

通過換液淘汰死細胞和受損較輕的細胞。待細胞全部恢復后再用。在這一點上操作時一定要特別注意。

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